Jego dzieła ukształtowały świadomość historyczną wielu pokoleń Polaków, podtrzymywały ducha narodu w czasach niewoli i świadczyły o jego bogatych oraz chwalebnych dziejach. Swoją twórczość traktował jako posłannictwo. Wychowany w głęboko patriotycznej atmosferze, pozostawał pod wpływem romantycznej poezji oraz krakowskiej szkoły historycznej.
Artysta pobierał nauki w krakowskiej Szkole Sztuk Pięknych, m.in. u W. Stattlera i W. Łuszczkiewicza. Studiował w akademii monachijskiej tylko przez rok z powodu choroby. Jeszcze krócej, zaledwie kilka dni, uczył się w Wiedniu, gdzie odszedł w wyniku nieporozumień z profesorem.
Od najmłodszych lat interesował się historią. Samodzielnie uzupełniał swoją wiedzę, tworząc notatki i rysunki, które stanowiły późniejsze podstawy jego koncepcji malarskich.
Znaczące prace olejne powstawały od 1855 roku. W 1860 roku zaprezentował litografie „Ubiory w Polsce”, opisujące polskie stroje. Jeden z najważniejszych obrazów artysty, „Stańczyk”, namalował w 1862 roku. Kolejny obraz, „Kazanie Skargi”, ukończył po upadku powstania styczniowego, za co otrzymał medal na Salonie w Paryżu.
Matejko odbył podróże m.in. do Stambułu, Wiednia i Paryża, gdzie w 1870 roku przyznano mu Legię Honorową. W latach 70. XIX wieku jego obraz „Unia lubelska” odniósł duży sukces. W tym czasie Matejko tworzył dzieła ukazujące zwycięskie wydarzenia w historii Polski, jednocześnie symbolicznie przedstawiając niewykorzystane okazje i możliwości. To był również najbardziej intensywny okres twórczy artysty.
W 1873 roku Matejko objął stanowisko dyrektora krakowskiej Szkoły Sztuk Pięknych. Przyczynił się do reorganizacji uczelni i miał decydujący wpływ na jej kształt przez kolejne lata. Wśród jego wychowanków było wielu znakomitych malarzy Młodej Polski.
Malarz wykonywał portrety arystokratów i bogatych mieszczan, traktując je jako działalność czysto zarobkową.
Matejko zdobył ogromne uznanie i szacunek wśród społeczeństwa, traktowano go nawet jako duchowego przywódcę narodu. W 1875 roku otrzymał złoty medal wykonany ze składek społecznych, a trzy lata później berło jako symbol panowania w sztuce. Artysta był honorowym obywatelem Krakowa od 1882 roku i uzyskał doktorat honoris causa Uniwersytetu Jagiellońskiego w 1887 roku.
Jednak w życiu prywatnym Matejko zmagał się z poważnymi problemami, takimi jak choroba psychiczna żony. Z czasem jego malarstwo również poddawano krytyce, zwłaszcza za obojętność na przemiany w sztuce i sposobie jej wykładania.
Jednak w życiu prywatnym Matejko zmagał się z poważnymi problemami, takimi jak choroba psychiczna żony. Z czasem jego malarstwo, obojętność na przemiany w sztuce oraz sposób jej wykładania zaczęły być krytykowane.
Warto pamiętać, że artysta aktywnie uczestniczył w pracach restauratorskich w Krakowie. Zajmował się również malarstwem monumentalnym, tworząc projekty polichromii do kościoła Mariackiego, które później zrealizowali Stanisław Wyspiański i Józef Mehoffer, oraz do auli Politechniki we Lwowie.
Jan Matejko brał udział w wystawach w wielu krajach europejskich. W Paryżu eksponował swoje dzieła od 1865 do 1887 roku, w Wiedniu od 1867, a w Berlinie od 1879. Uczestniczył także w wystawach w Monachium, Pradze i Lwowie. W kraju najwięcej wystawiał w Krakowie, gdzie odbyła się jego wystawa szkolna w 1854 roku oraz pośmiertna w 1893 roku. Corocznie brał udział w ekspozycjach Towarzystwa Przyjaciół Sztuk Pięknych. Jego prace były również prezentowane w warszawskim Towarzystwie Zachęty Sztuk Pięknych, Salonie Unegra i Salonie Krywulta. Wielokrotnie organizowano wystawy retrospektywne Matejki, m.in. w Muzeum Miejskim w Bydgoszczy w 1937 roku oraz w Muzeum Narodowym w Krakowie w 1953 i 1993 roku.